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PCR檢測試劑盒中的引物應(yīng)遵循哪些原則？
點擊次數(shù)：808 更新時間：2020-10-28
PCR檢測試劑盒參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：
?、僖镩L度： 15-30bp，常用為20bp左右。
?、谝飻U(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
?、垡飰A基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。PCR檢測試劑盒
?、鼙苊庖飪?nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點， 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
?、咭锏奶禺愋裕阂飸?yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。PCR檢測試劑盒
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