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實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡介：

兔胚胎肢芽間充質(zhì)干分離自胚胎肢芽；胚胎肢芽存在于兩棲類以上的大多數(shù)脊椎動(dòng)物胚胎中，在四肢發(fā)生的初期階段，在身體兩側(cè)有呈芽狀的突起，內(nèi)部是中胚層側(cè)板的體壁板垱厚形成，表面有表皮覆蓋。在這個(gè)中胚層區(qū)肢芽迅速伸長，不久，在其前端即見有指的突起。在此時(shí)期間，其內(nèi)部的中胚層分化成軟骨、肌肉等。這些分化組織，在將肢芽作分離培養(yǎng)的時(shí)候也可以獲得。根據(jù)對兩棲類的有尾類的研究，作為肢原基各部的胚發(fā)能力，肢芽物質(zhì)的大部分是位于背半部，而前半部主要參與基部形成，后半部參與前端的形成。在實(shí)驗(yàn)上，即使將肢的原基分成二半，每一半調(diào)整好都可形成基本上近于正常形態(tài)的肢體，而且肢體各軸的極性和側(cè)性也逐漸決定。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，是具有高度自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞；這些細(xì)胞可以通過分裂維持自身細(xì)胞的特性和數(shù)量，并在特定條件下轉(zhuǎn)變成為一種或多種構(gòu)成機(jī)體組織或器官的細(xì)胞，從而在組織修復(fù)等方面發(fā)揮積極作用。

方法簡介：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔胚胎肢芽間充質(zhì)干采用-膠原酶聯(lián)合消化法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實(shí)驗(yàn)室分離的兔胚胎肢芽間充質(zhì)干經(jīng)CD90免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣

傳代特性：可傳3-5代左右

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔胚胎肢芽間充質(zhì)干體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑颍瑐€(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

小鼠能a1A受體(ADRA1A)ELISA 試劑盒

Kappa aibodies to human immunoglobulin light chain (-IgLC) ELISA Kit 輕鏈kappa抗體(κ-IgLC)檢測試劑盒

HumanleucocyteaigenB27,HLA-B27ELISAKit 人類白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)檢測試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

FishhighsensitivityC-ReactiveProtein,hs-CRP檢測試劑盒魚類超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

真菌/酵母蛋白巰基/結(jié)合巰基含量比色法定量檢測試劑盒20次

MouseComplemefragme3a,C3aELISAKit小鼠補(bǔ)體片斷3a(C3a)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

ACE2重組食蟹猴 ACE2 / Angiotensin-Converting Enzyme 2 蛋白 Protein

Insulin protein (from porcine pancreas 0.5mgInsulin protein (from porcine pancreas) 豬胰島素

TLK1重組人 TLK1 / PKU-beta 蛋白 (His & GST 標(biāo)簽) Protein

IL18 Protein Human 重組人 IL18 / Interleukin 18 / IGIF 蛋白 (GST 標(biāo)簽)

IL36B Protein Mouse 重組小鼠 IL1F8 / IL36b 蛋白

Insulin protein (from porcine pancreas 0.5mgInsulin protein (from porcine pancreas) 豬胰島素

IL18 Protein Human 重組人 IL18 / Interleukin 18 / IGIF 蛋白 (GST 標(biāo)簽)

ACE2重組食蟹猴 ACE2 / Angiotensin-Converting Enzyme 2 蛋白 Protein

IL36B Protein Mouse 重組小鼠 IL1F8 / IL36b 蛋白

TLK1重組人 TLK1 / PKU-beta 蛋白 (His & GST 標(biāo)簽) Protein

豚鼠免疫球蛋白A(IgA)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human cytotoxic T lymphocyte associated aigen 4 (CTLA-4/CD152) ELISA kit E 人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4/CD152)檢測試劑盒E

Humanai-cardiolipinaibodyIgA,ACA-IgAELISAKit 人抗心0脂抗體IgA(ACA-IgA)檢測試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

HumancaneousTcell-atactingchemokine,CTACK檢測試劑盒人皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子(CTACK/CCL27)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

組織EPHB4激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次

HumanProgesterone，PROGELISAKit人孕激素/孕同(PROG)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

兔胚胎肢芽間充質(zhì)干細(xì)胞瑞氏－姬姆薩復(fù)合染液   Vascular permeability test solion

姬姆薩染液   Peroxidase staining

巴氏染液（脫落細(xì)胞染色）   Name

快速H－E組織細(xì)胞及脫落細(xì)胞染液   Phosphate buffer