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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

兔氣管平滑肌分離自氣管組織；氣管（Trachea），呼吸器官的一部分；為后壁略平的圓筒型管狀。上端平第六頸椎下緣，與環(huán)狀軟骨相連；向下至第四、五胸椎體（相當胸骨角平面）交界處，分左、右主支氣管，分叉處稱為氣管杈。氣管主要由14-16個半環(huán)狀軟骨構(gòu)成，有彈性，軟骨為“C"字形的軟骨環(huán)，缺口向后，各軟骨環(huán)以韌帶連接起來，環(huán)后方缺口處由平滑肌和致密結(jié)締組織連接，保持了持續(xù)張開狀態(tài)。管腔襯以粘膜，表面覆蓋纖毛上皮，粘膜分泌的粘液可粘附吸入空氣中的灰塵顆粒，纖毛不斷向咽部擺動將粘液與灰塵排出，以凈化吸入的氣體。氣管平滑肌是氣管的重要結(jié)構(gòu)組成之一，在機體的正常生理過程中發(fā)揮著重要作用；能夠保持氣道張力，維持氣道管狀形態(tài)，從而有利于氣體流通，保持肺部通氣。氣管平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細胞貼壁伸展，細胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細胞匯合，多數(shù)細胞伸展呈長梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏；細胞密度低時，常交織成網(wǎng)狀；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細胞生長較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長特點。氣管平滑肌細胞的異常是呼吸道疾病的重要病理特征之一，其增生、肥大是氣道重塑的關(guān)鍵。

方法簡介：

公司實驗室分離的兔氣管平滑肌采用-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合組織貼塊法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的兔氣管平滑肌經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

生長分化因子-3   英文名稱：   growth differeiation factor 3   規(guī)格：      英文縮寫：   GDF-3

膠質(zhì)纖維酸性蛋白   英文名稱：   glial fibrillary acidic protein   規(guī)格：      英文縮寫：   GFAP

生長激素釋放多肽Ghrelin   英文名稱：   peptide hormone Ghrelin   規(guī)格：      英文縮寫：   Ghrelin

胰高血糖素   英文名稱：   Glucagon   規(guī)格：      英文縮寫：   GC

豚鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat signal ansduction molecule 7 (Smad7) ELISA Kit 大鼠信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7(Smad7)試劑盒

HumancytosolicphospholipaseA2,cPLA2ELISAKit 人胞漿型0脂酶A2(cPLA2)試劑盒 96T/48T 進口分裝

Humancrystalproteinsβ,Cryβ試劑盒人晶體蛋白β(Cryβ)試劑盒規(guī)格：96T/48T

組織EBV(EPSTEIN-BARR)病毒定性試劑盒20次

HumanProstaglandinDSyhase,PGDSELISAKit人前列腺素D合成酶(PGDS)試劑盒規(guī)格：96T/48T

HA重組甲型流感 H1N1 (A/New York/1/1918) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 Protein

PACAP(6-38 Peptide 0.5mgPACAP(6-38 Peptide) 腺苷酸環(huán)化酶激活肽6-38

LILRB3重組人 LILRB3 / LIR3 / ILT5 / CD85a 蛋白 Protein

IL12A & IL27B Protein Human 重組人 IL12A & IL27B Heterodimer 蛋白

ACE2 Protein Human 重組人 ACE2 / Angiotensin-Converting Enzyme 2 蛋白 (Fc 標簽)

PACAP(6-38 Peptide 0.5mgPACAP(6-38 Peptide) 腺苷酸環(huán)化酶激活肽6-38

IL12A & IL27B Protein Human 重組人 IL12A & IL27B Heterodimer 蛋白

HA重組甲型流感 H1N1 (A/New York/1/1918) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 Protein

ACE2 Protein Human 重組人 ACE2 / Angiotensin-Converting Enzyme 2 蛋白 (Fc 標簽)

LILRB3重組人 LILRB3 / LIR3 / ILT5 / CD85a 蛋白 Protein

兔氣管平滑肌細胞大鼠抗存活素抗體(Ai-Surv)試劑盒 ，英文名： Ai-Surv ELISA Kit

Monkey adrenomedullin (ADM) ELISA Kit腎上腺髓質(zhì)素(ADM)試劑盒

RatCompleme4,C4ELISAKit 大鼠補體蛋白4(C4)試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforFree-T3(HumanFreei-iodothyronineIndes)ELISAKit人游離三甲狀腺原

細胞活化10(FACTORXa)活性熒光定量試劑盒20次

Ratpigmeepithelium-derivedfactor,PEDFELISAKit大鼠色素上皮衍生因子(PEDF)試劑盒規(guī)格：96T/48T